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孕脉健康:辅助生殖中胚胎培养和培养液

 
 
 
 
培养液能提供胚胎生长最重要的物质环境,其含有多种胚胎发育所需的营养。现今,商品化的培养液已被证实能很好地支持人类胚胎体外正常发育和生长(见图01)。
 
此外,小鼠胚胎检测(MEA)能有效地验证培养液的有效性。市场上的胚胎培养液在上市前都经过MEA的验证,即在有效培养系统下,小鼠胚胎在体外能获得与体内相似的发育速度与质量(见图02),以此证明培养液的安全性和有效性。
 
 
图01: 从卵裂到囊胚
 
 
图02: 体外培养第五天的小鼠胚胎
 
 
人类培养液的配方和质量在过去四十年中逐步优化和提高,优质胚胎和囊胚的形成率因此不断提升,进而提高了妊娠率。与此同时,专家们对培养液存在两种不同的配方策略,即序贯培养液和单一培养液。
 
序贯培养液基于“回归自然”的理念,让胚胎获得不同生长时期所需的不同营养成分,因此专家们针对胚胎体外培养的不同阶段配制了不同配方的培养液,即卵裂培养液和囊胚培养液(以下是两种不同培养液的成分配比)。
 
卵裂培养液
 
氯化钾,氯化钙,硫酸镁,碳酸氢钠,氯化钠,磷酸二氢钠,乳酸钠,丙酮酸钠,葡萄糖,透明质酸,青霉素,人血白蛋白,丙氨酸,丙氨酰谷氨酰胺,天冬酰胺,天冬氨酸,乙二胺四乙酸,谷氨酸,甘氨酸,脯氨酸,丝氨酸,牛磺酸等。
 
囊胚培养液
 
氯化钙,泛酸钙,硫酸镁,氯化钾,碳酸氢钠,氯化钠,磷酸二氢钠,乳酸钠,丙酮酸钠,葡萄糖,透明质酸,青霉素,人血白蛋白,盐酸吡哆醛,核黄素,硫胺,丙氨酸,丙氨酰谷氨酰胺,精氨酸,天冬酰胺,天门冬氨酸,胱氨酸,谷氨酸,甘氨酸,组氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,赖氨酸,蛋氨酸,苯丙氨酸,脯氨酸,丝氨酸,苏氨酸,色氨酸,酪氨酸,缬氨酸等。
 
从上述成分信息中,我们能对比出两种培养液既有相同部分,也存在差异,以满足胚胎在不同阶段的营养需求。
 
 
单一培养液则秉持“让胚胎选择”的培养策略,即提供胚胎体外培养整个进程中所需营养物质,让胚胎在发育的过程中自行选择吸收哪种营养物质,减少非必要的人为干预。
 
 
当然无论选择哪种策略的培养液,其目的均是为了胚胎能更好地存活,专家们通过小鼠试验和临床研究发现相对低的代谢水平有助于胚胎存活,并总结了以下情况最利于种植前胚胎的存活。
 
整体代谢水平最低(限度尚待确定)
 
最低糖酵解率(小鼠研究成果)
 
最低氨基酸周转率(人类研究结果)
 
抗氧化酶水平高
 
综合以上情况,我们能大致总结出几条胚胎培养液的设计思路:
 
01. 胚胎应该在相对安静代谢的培养基中,而不是相对活跃的胚胎代谢。
 
02. 营养物质的浓度可能需要保持相对低水平。
 
03. 胚胎体外发育时,通过提供底物,引导胚胎采用相应的代谢模式来利用内源性营养物质。
 
 
依据以上设计思路,专家们对其中的“营养物质的浓度可能需要保持相对低水平”进行了前瞻性临床论证,即对比两种不同乳酸水平的培养液(两者乳酸水平相差6倍)在年龄23-40岁的107名患者中的使用效果,得出的结论是在低乳酸培养基中培养的胚胎移植、妊娠和持续妊娠的比例更高(见下图)。
 
 
高乳酸的培养液的囊胚形成率设置为100%,其它数据为相对值
 
 
拓展研究

 
专家们进一步发现细胞内pH值的轻微变化可以显著影响胚胎发育和生存能力,而在体外受精培养环境下的pH值主要由培养箱提供的可调二氧化碳浓度和培养液中的碳酸氢盐浓度来调节,即在已设定碳酸氢盐浓度的培养液中,通过调节培养箱中二氧化碳浓度来调节pH值,两者成反比关系。
 
 
 
二氧化碳调节pH值的反应方程式
 
 
而通过以下小鼠对比试验,我们能尝试找出更适合体外受精培养的pH值。
 
试验方法
采用小鼠卵母细胞与精子进行体外受精,然后将受精后的胚胎置于培养液中培养,分别将培养液的pH值设在7.05、7.20、7.35、7.50、7.65,观察、计数D1天受精率、D2天卵裂率、D4天囊胚形成率、D5天囊胚孵出率,应用激光共聚焦显微镜观察胚胎纺锤体的改变情况。
 
试验结果
培养箱内培养液pH值对小鼠体外受精及胚胎发育的几个参数(配子受精率、卵裂率、囊胚形成率、囊胚孵出率)皆有影响。
 
配子受精率在pH7.50最高,pH7.05与7.20组比较有统计学差异(P<0.005),pH7.20与7.65组比较无统计学差异(P>0.005),说明在7.20-7.65之间较适合配子受精。
 
卵裂率在pH7.35最高,pH7.05与7.20组比较有统计学差异(P<0.005),pH7.20与7.50组比较无统计学差异(P>0.005),pH7.5与7.65组比较有统计学差异(P<0.005),说明在7.20-7.50之间较适合受精卵卵裂。
 
囊胚形成率在pH7.50最高,pH7.05与7.20组比较有统计学差异(P<0.005),pH7.20与7.50组比较无统计学差异(P>0.005),pH7.50与7.65组比较有统计学差异(P<0.005),说明在7.20-7.50之间较适合囊胚形成。
 
囊胚孵出率在pH7.35最高,pH7.05与7.20组比较有统计学差异(P<0.005),pH7.20与7.50组比较无统计学差异(P>0.005),pH7.50与7.65组比较有统计学差异(P<0.005),说明在7.20-7.50之间较适合囊胚孵出。
 
结语
 
由上可知,胚胎的发育和生长除了受到培养液成分不同的影响之外,还受到培养箱内因二氧化碳浓度调节而变化的pH值的影响。此外,空气的质量、温度、渗透压等因素也会对其产生影响。

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